菌种保藏方法的优缺点_菌种保藏方法

1.菌种保藏的原理，菌种保藏方法

2.菌种保藏的目的，菌种保藏的方法有哪些

3.第二节—菌种保藏方法

4.常用的蛹虫草菌种保藏方法有哪些？

5.菌种保藏的原理

6.实验室菌种保存有哪些方法呀

7.什么是菌种的低温保藏法？

1、液体石蜡保存法就是在斜面菌种或穿刺菌种表面覆盖一层液体石蜡，从而隔绝空气，减少菌种及培养物水分挥发，保藏温度要求在4℃下即可。

　2、沙土保存法沙土保藏法是将菌种吸附在适当的载体上，而后进行干燥的保藏。将培养好的菌种接入沙土管内，用真空泵抽气至干。细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14-17年之久。

　3、甘油管保存法甘油管保存是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。配置30%浓度的无菌甘油，将培养好的菌种与甘油充分混合均匀，放入-20℃保存。

　4、冷冻干燥保藏法冷冻干燥保存法就是将菌种与保护剂混合均匀后，快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分，兼具低温、干燥、除氧三方。干燥后的菌种在真空环境下可长期保存。

菌种保藏的原理，菌种保藏方法

菌种保藏是食用菌产业的一项基础工作，是确保野生种质基因留存和现有生产用种遗传性能相对稳定的必要手段。菌种保藏的方法多种多样，有的虽然保藏效果好，但投资高或操作繁杂。在生产实践中，更需要设备投入少，能保障菌种不死亡、不污染、最大限度地保持优良种性的简便方法，如斜面低温短期保藏和自然基质较长期保藏相结合的方法。

一般而言，对母种进行长期保存，对原种进行短期保存。须保证优良菌种的性状和活力不发生变异，不死亡，不被污染，确保其纯度。因此，保存方法应具备取材容易、操作方便、菌种不易退化、长期保存不污染杂菌等优点。常用的菌种保存方法如下：

（一）斜面低温保藏 该法的优点是保藏方便且所占空间较小。具体做法是：菌丝长满斜面后，放在0～5℃保存。以后每隔一定时间（2～3个月）转管一次。转管保存不能长期用PDA培养基，否则种性易退化，灰树花降解木质纤维素的能力减弱。因此隔一定时间（1年左右）须把菌种转接到木屑培养基上复壮，之后挑选健壮无污染的菌丝再转回PDA培养基保存。在长期保存过程中，要防棉塞受潮滋生杂菌。菌种试管口最好用蜡烫封，以防培养基内水分过快蒸发。增加琼脂用量（2.5%～3%）可减缓水分蒸发。还要防止菌种管上的标签脱落而造成种系混杂。

斜面低温保藏方法简便易行，能随时观察保藏菌株的活力和纯度，一旦染杂，肉眼能及时发现。

（二）自然基质保藏 此法是根据灰树花的特性，利用自然基质保藏其菌种的方法。灰树花是木腐菌，可以用以木屑为主料的培养基。自然基质营养全面，且大部为缓释养分，不易产生营养过剩或饥饿；其次，培养基理化性状好，可吸收或缓冲菌丝代谢出的有害物质，水分与通气协调平衡，部分菌丝扎入基质内生长，不裸露于空气中，菌丝呼吸强度低，生命力强。

1.原料与配方 粗、细木屑比例适当，用板栗树木屑最佳，粗木屑粒径为2毫米左右，细木屑为一般圆盘锯屑，粗、细的比例为1∶2，添加干木屑重量20%的麸皮和1%的糖，含水率为60%左右。这样的基质通气性好，营养丰富且供菌丝分解利用的时间长，长到基质内部的菌丝比包裹在基质外部暴露于空气中的菌丝耐受性强。不同粒径的基质比例适当，还能协调气与水的矛盾。粗粒过多，架空菌丝多；细粒过多，透气性差，菌丝生长慢。应用配方如下：

栗木屑78%，麸皮20%，石膏1%，蔗糖1%，水65%配料，装入较粗大的试管中，装料量为试管的1/3～1/2，1.5千克/厘米2灭菌1.5小时。冷却后，接入需保藏的菌种，在28℃下培养，待菌丝长满木屑培养基时取出换上无菌橡皮塞，在0～5℃冰箱内保藏1～2年转管一次。

2.容器与装量 用容量250毫升的葡萄糖玻璃瓶，清洗洁净，装量一般不超过玻璃瓶容量的3/5，填料不能过满，瓶壁所残留的颗粒须擦拭干净，否则保藏的菌种易引起污染。

3.灭菌和冷藏 灭菌时若用棉塞封口，基质表层易失水，接种成活率低，即使菌丝复活，生长也很缓慢，所以最好用聚丙烯膜封口，接种后换用无菌棉塞培养，待菌丝长满后再换成有孔灭菌胶塞冰箱保藏。

用上述方法保藏的菌种经3年贮放后，接出成活率均达90%以上，出菇验证产量及子实体形态特征均无明显变化。因此，自然基质保藏法具有保存期长，菌种遗传性能相对稳定的特点。

（三）木粒PDA斜面保藏 灰树花在自然状态下易发生于栗树根部，这说明其营养需求较为特殊。根据灰树花这种习性，在PDA基础上添加适量的栗树木粒制成母种培养基。在多年的使用中发现，用该培养基培养的母种生长势好，在转接原种时，适应能力强，萌发定植快；用作菌种保藏基质时，保藏时间长，并能很好保持菌种的优良性状。

1.木粒PDA的制作 选取栗树边材，加工成0.3～0.5厘米的颗粒，及时烘干或晒干备用。称取葡萄糖10克，KH2PO41克，1溶解于1升清水中配制成营养液。将营养液倒入盛有木粒的小铝锅中，营养液以完全浸没木粒为准。煮沸10分钟，以加快木粒对营养液的吸收速度，起锅静置30分钟让木粒吸足营养液。捞出木粒，沥掉表面的水，装入试管，装量为试管长的1/6，最多不得超过试管长的1/5，否则在摆制斜面时，不易使木粒均匀分散于斜面的表面上。

选取新鲜的马铃薯，去皮并切成薄片，称取200克放入小铝锅中，加入1升清水，文火煮沸30分，趁热过滤取汁，并补足1升的体积。称取琼脂20克，葡萄糖20克，KH2PO4 2克，MgSO47H2O 2克。先将琼脂剪碎，加入到马铃薯滤液中，继续用文火加热，使琼脂溶化。待琼脂完全溶化后，加入称好的其他3种营养成分，搅拌使这些物质溶解均匀，趁热装入已装有木粒的试管中，装至试管长的1/3处，塞上棉塞。

在0.8～1千克/厘米2蒸气压下灭菌40分，待气压降至0时，开盖取出，趁热轻轻抖拍试管，使木粒分散后即可摆制斜面，并使木粒呈半裸状分布于斜面上，待凝固后便制成了木粒PDA培养基。

2.生长及保藏效果 木粒PDA斜面上培养的灰树花母种，菌丝生长迅速、良好，12天即可长满试管，但菌丝的后期生长势更为粗壮、浓密，后劲足。转接原种时，菌种适应力强，定植快。这表明，灰树花菌丝的生长速度、生长势不仅取决于本身的遗传性，而且很大程度上取决于培养基的营养。常规PDA的营养成分，主要是可溶性的速效性营养，前期营养丰富，营养利用直接，因而前期菌丝生长迅速、良好，后期营养则不足，菌丝生长不良，长势欠佳。木粒PDA由于在增添了木粒这一缓效性营养，就木腐性的灰树花而言，营养配伍合理，补充了菌丝生长后期所需的营养，因此后劲足。

菌丝体对基质的分解利用是通过菌丝细胞分泌的胞外酶，将基质中的大分子营养分解成小分子营养后才被吸收利用的，而这些胞外酶大多为诱导酶，其合成与分泌受基质的诱导和分解产物阻遏机制调节。就纤维素酶而论，许多易代谢碳源（如葡萄糖等）具有引起酶合成阻遏作用，同时伴随着菌丝体的旺盛生长，酶的大量合成则出现在易代谢碳源基本耗尽之后，且受到基质纤维素的诱导，常规PDA基质，到葡萄糖等易代谢碳源基本耗尽的后期，由于营养的缺乏，菌丝生理机能下降，酶的合成量减少。而木粒PDA不仅含有易代谢碳源——葡萄糖，又含有木粒这一缓效性营养，前期葡萄糖促进了菌丝体旺盛生长，获取了大量的菌丝体，表现为菌丝粗壮、浓密。到了易代谢碳源耗尽的后期，木粒一方面补充了后期所需的营养，使菌丝的生埋机能维持在一定的水平；另一方面木粒的纤维素激活菌丝细胞纤维素酶的诱导机制，合成了大量的酶，保持了木腐生性灰树花较强的分解木材的能力，因此，用该培养基培养的母种在转接原种时适应力强，萌发定植快。因部分菌丝长入木粒内部，抵抗不良环境的生存能力增强，种质不易退化。木粒PDA灰树花菌种，在0～5℃保藏2～3年再转管活化，成活率仍达到90%左右。此外，木粒PDA应用于木腐性灰树花种的提纯复壮，效果也较理想。

（四）石蜡隔氧封藏 具体做法是将液态石蜡分装入三角瓶内，装量达瓶空间的1/3，塞好棉塞，于121℃灭菌2小时，然后置40℃温箱中，使其水分蒸发，或置于干燥器内数日以除去水分，石蜡呈透明状为宜。在无菌条件下，用无菌吸管装入已长好菌丝的斜面试管，使液面高出斜面顶部1厘米左右。塞上无菌橡皮塞，竖直保存。此法可使菌种存活3年以上，但以1～2年移植一次为好。移植时不必倒出石蜡，用接种钩取一块菌丝即可。因转移时带有石蜡，菌丝生长弱，需要再转管1～2次，方能复壮。

菌种保藏的目的，菌种保藏的方法有哪些

回答1、菌种保藏的原理：菌种保藏有多种方法，其原理大多大同小异，主要是人为创造条件尽量降低生物体内的代谢活动，以达到延长生命、减少变异的目的，其中低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素。2、菌种保藏方法：菌种保藏常用的方法有冻干保藏法、液氮保藏法、甘油管冷冻保藏法、传代培养保藏法、寄主保藏法、载体保藏法等。

一、菌种保藏的原理

1、菌种保藏的原理是根据菌种的生理生化特性，人为创造条件尽量降低生物体内的代谢活动，以达到延长生命、减少变异的目的。在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

2、低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，因此菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。其中低温可减缓机体细胞的酶活，降低新陈代谢，达到保藏菌种的目的，同时会导致菌体诱发菌丝自溶机制。

二、菌种保藏方法

常用的方法有冻干保藏法、液氮保藏法、甘油管冷冻保藏法、传代培养保藏法、寄主保藏法、载体保藏法等。

1、冻干保藏法

冻干保藏法是最有效的方法之一，具体为：先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥），其中真空冷冻干燥法最常见。

2、液氮保藏法

液氮保藏法，又称为超低温保藏法，主要利用微生物在低于-130?C的低温下新陈代谢趋于停止的原理，在液氮中（-196?C的超低温下）有效地进行菌种保藏的方法。该方法一般可保藏15年以上，是公认的菌种长期保藏技术之一。

3、甘油管冷冻保藏法

甘油管冷冻保藏法，利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。该方法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果好，无变异现象发生。

4、传代培养保藏法

传代培养保藏法，又称定期移植保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等，是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待菌种生长完全后，通常置于4℃-6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

5、寄主保藏法

寄主保藏法相当于一般微生物的传代培养保藏法，必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，尚不能用于在人工培养基上生长的微生物，如、立克次氏体、螺旋体等。

6、载体保藏法

载体保藏法，将微生物吸附在适当的载体如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

第二节—菌种保藏方法

1、目的：尽可能的保持菌种的原有性状以及活力的稳定，保证菌种不死亡、不发生变异、不被外物污染，保持菌株的优良性状不发生退化以及优良菌株的存活。2、原理：通过降低微生物体内的代谢，抑制生长繁殖，从而延长菌种的生命，减少变异，常用的方法为低温保藏、缺氧保藏、干燥保藏。

一、菌种保藏的目的

1、目的

在使用和传代的过程中，菌种容易出现污染，发生变异，死亡等情况，从而导致菌种衰退，优良菌种丢失。而菌种保藏的目的就是为了尽可能的保持菌种的原有性状以及活力的稳定，保证菌种不死亡、不发生变异、不会被外物污染，保持菌株的优良性状不发生退化以及优良菌株的存活。

2、原理

菌种保藏的原理是通过降低微生物体内的代谢，抑制生长繁殖，从而延长菌种的生命，减少变异。常用的方法主要为低温保藏，缺氧保藏，干燥保藏。除此之外，避光，添加保护剂，缺乏营养等也可以提高保藏的效果。

二、菌种保藏的方法有哪些

1、斜面低温保藏法

将菌种接种到适合的固体斜面培养基上，等到菌种充分生长过后，使用油纸将棉塞部分包扎好，然后转移至2-8℃的冰箱中进行保存。

2、液体石蜡保藏法

（1）使用三角烧瓶将液体石蜡装好，塞上棉塞，并用牛皮纸进行包扎，0.1MPa，121.3℃灭菌30分钟左右，然后转移至40℃的温箱中，将水汽蒸发掉。

（2）将菌种在斜面培养基中培养，得到健壮的菌体，然后使用灭菌吸管将石蜡注入斜面上，用量为高出斜面顶端1cm为宜。

（3）将试管直立，放置在低温或者室温的环境下进行保存。

3、滤纸保藏法

（1）准备好滤纸条（0.5?1.2cm），装入安瓿管中（0.6?8cm），每个管中放入1-2张，然后塞上棉塞，在0.1MPa，121.3℃的环境下灭菌30分钟。

（2）将菌种在斜面培养基中培养，得到健壮的菌体，然后取出1-2ml的灭菌脱脂牛乳，滴加在灭菌培养皿内，接着取数环菌苔在牛乳内混合均匀，制成浓悬液。

（3）使用镊子将滤纸条夹出，浸入菌悬液内，吸饱后，放回安瓿管中，塞上棉塞。

（4）将安瓿管放入装有五氧化二磷的干燥器，并用真空泵抽气至干，然后将棉花塞入管内，用火焰熔封，放置在低温下保存。

（5）当需要使用菌种的时候，将安瓿管口在火焰上烧热，在烧热的部位滴上一滴冷水，使玻璃破裂，再用镊子将瓶口端的玻璃敲掉，等到打开安瓿管后，将滤纸取出，放入液体培养基内，置温箱中培养。

4、沙土保藏法

（1）取出河沙，加入10%稀盐酸，加热煮沸30分钟（除去有机质）。

（2）将酸水倒掉，并用自来水将河沙洗至中性，然后进行烘干，过筛（40目筛子），将粗颗粒去掉。

（3）取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，浸泡洗涤数次，直至为中性。

（4）烘干，碾碎，过筛（100目筛子），去除粗颗粒。

（5）将沙和土按照2：1的比例混合，装入试管中，塞好棉塞，灭菌30分钟左右。

（6）将菌种在斜面培养基中培养，得到健壮的菌体，然后向斜面培养物中注入3-5ml无菌水，洗下细胞或孢子制成菌悬液。

（7）用无菌吸管吸取菌悬液，均匀滴入沙土管中，每管0.2-0.5ml，然后真空抽去管中的水分。如果是放线菌和霉菌可以直接挑取孢子拌入沙土管之中。

（8）将沙土管用火焰熔封，然后放置在低温（4-6℃）干燥处保藏，或者是将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥器内保存。保存过程中，需要每隔半年检查一次菌种的存活性和纯度。

5、甘油管保存法

（1）将80%的甘油进行高压蒸汽灭菌。

（2）将菌种放置在斜面培养基上培养，然后使用无菌水制成高浓度的菌悬液。

（3）使用1ml的甘油与菌液混合均匀，让甘油的浓度为10-30%左右，然后将其放置在零下70℃的环境下进行冻存。

（4）也可以使用甘油-生理盐水（体积比8：2），和菌体肉汤混合均匀，然后放置在零下20℃的环境下进行保存。

6、冷冻干燥保藏法

（1）在低温下将细胞快速冻结，然后在真空条件下进行干燥，同时为了保证细胞在冷冻和水分升华的过程中不受损害，应当使用保护剂来制备细胞细胞悬液（菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质），通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。

（2）干燥后的菌种在真空下封装，和空气隔绝，从而实现长期保藏。

（3）该方法兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除开丝状真菌的菌丝体外，其它各类微生物大多都适用。

常用的蛹虫草菌种保藏方法有哪些？

菌种保藏是一种使微生物处于一种休眠状态的保存方法

在什么环境下它会处于休眠状态？恶劣的环境中，比如低温，干燥，真空的环境下

接下来我们来学习一下菌种保藏的三种常用方法

一：甘油冷冻保藏

首先将待保存菌种接种到斜面上培养，然后挑取少量到无菌蒸馏水中，最后是加入等体积20%甘油的TSB溶液，混匀，分装在冻干管中置-30～-80摄氏度的冰箱中保存。

菌种活力可以达到一年，但在保存过程中需要定期检测菌种是否死亡，变异等问题

挑选菌种保存的要求是：可以在恶劣环境中生长出芽孢或有孢子的生物体，因为芽孢和孢子代谢小，抵抗恶劣环境的能力强

二：琼脂斜面保存

这个也是实验室常用的保存方法，一般两到三个月转种一次，传代次数不超过五代。为了减少培养基的水分蒸发，用橡胶塞塞住试管口，用牛皮纸将试管口包扎可以避免污染

三：液体石蜡保存

将菌种接种在半固体培养基上，加入液体石蜡混匀，分装置4摄氏度冰箱保存。石蜡的量以不超过斜面1cm为宜，太多会阻碍气体交换，太少培养基易干燥

总结一下这一节讲了我们常用的三种菌种保藏的方法：斜面保存法，液体石蜡保存法，甘油冷冻保存法，还有一点要注意的是，我们长时间保存菌种的培养基要选用无糖或少糖的，因为避免在保存的过程中产酸过多影响菌种生长

菌种保藏的原理

在实践中，人们尝试了许多保藏方法，如继代培养保藏法、液体石蜡保藏法、蒸馏水保藏法、冷冻干燥保藏法。这些方法各有利弊，在实践中要根据保藏的目的、资金及设备状况等因素，选择最佳保藏方法。

1.斜面培养基冰箱保藏法这是最常用的菌种保藏方法。因为它简单易行，不需特殊设备，并能随时观察保藏菌种的情况。因此，短时间保藏菌种，一般都用此法。

将需要保藏的菌种接种在斜面培养基上，在适宜的温度下培养，当菌丝健壮地长满斜面时，即可将此试管菌种取出，放在4℃的冰箱中保藏。用于保藏菌种的棉塞，要用硫酸纸包扎，防止霉菌污染。冰箱保藏蛹虫草菌种，一般1个月转管一次。

冰箱保藏，虽然简单易行，但温度不够低，只有4℃左右，蛹虫草的新陈代谢活动并未停止，而试管斜面也易失水变干。因此，保藏时间较短，1个月就需转管一次，转管次数多了，变异的可能性也就增大，不适宜长期保藏菌种。若保藏时间超过1月，菌种的转色与出草能力明显下降。

2.大米培养基冰箱保藏蛹虫草在大米培养基上培养后在冰箱内能保藏较长的时间，根据试验，保藏5个月菌种质量无明显变化。

3.蚕蛹基质保藏法以家蚕蛹为培养基保藏蛹虫草，在冰箱保藏4个月或在室温下保藏1个月，均未发现明显的变化，生产上多用此种方法。

用大米及家蚕蛹培养基在三角瓶保藏菌种，保藏的菌丝体相对较多，基质不易干燥，生产上使用方便。

4.矿油保藏法矿油（主要是液体石蜡）保藏，也称液体石蜡保藏。此法简单易行，无需另添设备，各生产单位均可应用。矿油能隔绝气体交流，防止培养基水分蒸发，抑制微生物代谢，推迟细胞衰老，能延长微生物的生命。

（1）培养基常用的培养基配方为20%的马铃薯汁500ml，5%的蚕蛹汁500ml，蛋白胨5g，磷酸二氢钾（KH2PO4）3g，硫酸镁（MgSO4H2O）1.5g，葡萄糖20g，维生素B1微量，琼脂15g，pH6.5，1kg/cm2灭菌30min。

（2）矿油处理选用化学纯的液体石蜡（要求不含水、不霉变、比重为0.865～0.890），分装于三角瓶中，装至瓶体的1/3处，塞好棉塞；另配一套具有虹吸管的橡皮塞，用纸包好，与三角瓶一起于1kg/cm2灭菌30min。灭菌后，将液体石蜡放在40℃的温箱中，使液体石蜡中的水分蒸发干净，至石蜡液呈完全透明为止。

（3）接种培养将需保藏的菌种，接入斜面培养基上，在20℃左右下培养，待斜面长满健壮菌丝后，取出装入矿油。

（4）矿油灌注将上述菌种和无菌矿油放入无菌室（箱），把有虹吸管的橡皮塞装上矿油三角瓶，无菌操作使矿油注入斜面试管内（少量菌种也可用无菌吸管灌注），使液面高出斜面顶部1cm。

（5）菌种保藏将灌注矿油的试管直立放在试管架上，于室温或冰箱中保藏均可。室温保藏的环境应注意通风干燥，以免棉塞发霉，并要定期检查。如矿油覆盖的斜面明显变浅，应及时补充无菌矿油，切忌培养基露出液面。

液体石蜡易燃，使用时需加注意。从覆盖矿油斜面中移植菌种时，应尽量少带矿油。因矿油在火焰灭菌时，会爆炸飞溅。

以后用作菌种时，可从斜面上挑取少许培养基，接种在新鲜的培养基上，经过培养，即可使用。

5.双重橡皮栓法用普通的斜面培养基先培养菌丝，用双重橡皮栓取代棉塞。这种双重橡皮栓要预先用氧化丙烯灭菌，方法是按1L容器注入1ml氧化丙烯，原封放置待用。用蒸汽容易使橡皮变软，而用氧化丙烯等灭菌方法可以避免此弊，利用双重橡皮栓能防止空气进入试管，从而达到与液体石蜡同样的效果。

6.水箱中保藏法把蛹虫草菌种悬浮在不含有机营养成分的水管中保存，一般用的悬浮液有蒸馏水、食盐水、用蒸馏水时，在接有蛹虫草菌种的琼脂培养物中加入6～7ml蒸馏水，使细胞、孢子或蛹虫草菌丝充分悬浮，尔后转入试管内，密封后室温下保藏。用食盐水时，把在琼脂培养基斜面上长好的菌丝悬浮在1%的食盐水中，密封后在室温条件下保存。

7.液氮超低温保藏法此法是将菌种密封在含保护剂的安瓿管内，经控制速度冻结后，在－150～－196℃液态氮超低温罐中保藏。

（1）菌种制备保藏孢子时，取孢子制成悬液，加入保护剂，装入无菌安瓿管内。保藏菌丝体时，用液体振荡法培养菌丝球，或用平板培养菌丝体，也可用麦粒菌种。取适量放入无菌的装有保护剂的安瓿管内。

（2）安瓿管制作安瓿管的玻璃，要能经受温度突变而不破裂，容易用火焰封管口，恢复培养时容易打开。一般用硼硅玻璃，管的大小根据需要而定，通常是75mm0mm或能容1.2ml液体的安瓿瓶比较合适。选好安瓿管后，每管加进0.8ml保护剂，塞上棉塞，1kg/cm2灭菌15min，作冻结琼脂菌丝片或麦粒菌种用。如冻结孢子悬液时，则空管灭菌。

（3）保护剂用10%（体积比）甘油蒸馏水溶液或10%二甲亚砜（dimethylsulfoxide）蒸馏水溶液作保护剂。

（4）冻结保藏将上述准备好的菌种无菌操作移入加有保护剂的安瓿管中，用火焰将安瓿管上部熔封，浸在水中检查有无漏气。然后将封口的安瓿管放在慢速冻结器内，控制冻结速度（每分钟下降1℃），使样品逐步均匀地冻结到－35℃。－35℃以下的冻结速度，可不用控制而迅速下降。安瓿管冻结后，立即放入液氮罐中。罐内的气相温度为－150℃，液体温度－196℃。

（5）恢复培养保藏菌种时，将安瓿管从液氮罐中取出，立即放入38～40℃的水中摇荡至管内冻结物全部融解，开启安瓿管，将管内菌种接入适宜培养基培养即可。

液氮超低温保藏，是目前长期保藏菌种的最好的一种方法。用它进行保藏各类微生物和活细胞的试验，都获得了满意的结果。对那些难以保藏的或只产生菌丝的真菌，用此法保藏也很成功。

现在，普遍对液氮保藏的效果都持乐观态度，认为液氮保种很少或不会引起细胞中遗传物质的变化。而且液氮保藏后菌株出现的问题却很少报道。然而，Fritssdu首先在荷兰Horst发现杂交菌株U1经液氮保藏3年后出现退化，部分培养物产量下降，出现硬开伞，经组织分离培养后，产量质量又恢复正常。据她认为，经原生质体重新融合产生的杂交菌株，其本身对不利因素（如超低温的刺激）适应性差，故在液氮保藏中必须考虑到这一影响。而且反复的冷冻和解冻也会使菌株受到不同程度的损伤。

另一方面，液氮保藏本身也有不足之处，问题在于液氮保藏系统成本高，有些地方液氮不足，使一般保藏中心不能单独依靠这一保藏技术。而且液氮保藏的菌种，首先必须培养在琼脂培养基或液体培养基中，对邮寄交流造成一定麻烦。

一般认为，在未经有效可靠检测之前，从液氮保藏中取出的菌种尤其是杂交菌株，不宜作当年产季的生产用种，必须经过出菇试验，以确保无退化或无变异才能投入生产。

干燥保藏的作用原理在于除去蛹虫草菌丝细胞的游离水，以达到除去细胞代谢的液相环境，从而使代谢活动停滞并进入休眠状态，有利于长期保存。

实验室菌种保存有哪些方法呀

菌种保藏基本原理是使微生物的生命活动处于半永久性的休眠状态。

知识扩展：

一、冷冻干燥保藏法

先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥），其中真空冷冻干燥法最常见。

真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。

真空冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要用保护剂来制备细胞悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质。

通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。即是使样品中的水分在冰冻状态下，抽真空减压，使冻结的冰直接升华为水蒸气，使样品达到干燥。干燥后的微生物在真空下封装，与空气隔绝，达到长期保藏的目的。

二、沙土保藏法

1、取河沙加入10%稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。

2、倒去酸水，用自来水冲洗至中性。

3、烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。

4、另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。

5、烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。

什么是菌种的低温保藏法？

1、液体石蜡覆盖法：他是指斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，不但可以阻止氧气进入，同时又可以避免菌种死亡。

2、就是在动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。

3、是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法。

4、可以用低温冰箱，干冰酒精快速冻结，氮气等保存。

5、先使微生物在极低温度(-70℃左右)下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分(真空干燥)。

将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞或者硅胶塞，放置在4℃的冰箱中保藏，叫做斜面（菌种）低温保藏法。由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干。因此，保藏时间较短，不适于长期保藏。每隔3～6个月应转管一次。草菇菌种不耐低温，需保藏在10～12℃之间。或在草菇菌落上灌注3～4毫升的防冻剂（10%的甘油）。当菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。据测定，保藏3年的菌种生活力仍很旺盛。